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CNVs-miRNA在先天性主动脉弓狭窄发病机制中的作用研究
添加时间: 2016-9-2 11:23:02 来源: 作者: 点击数:2281

CNVs-miRNA在先天性主动脉弓狭窄发病机制中的作用研究

先天性心脏病是出生缺陷中发病率最高的疾病,目前没有发现先天性心脏病确切的病因和发病机制。前期我室在先天性主动脉弓狭窄的研究中发现异常胎儿存在18pter-p11.21染色体片段拷贝数增加,推测它极可能与先天性主动脉弓狭窄的发病机制密切相联。本研究拟收集先天性主动脉弓狭窄胎儿和心脏正常胎儿血液、组织样本,通过Real-time PCR验证先天性主动脉弓狭窄胎儿的染色体拷贝数差异,采用miRNA-Seq检测主动脉弓血管组织的miRNA差异,然后通过HITS-CLIP检测先天性主动脉弓狭窄差异miRNA的靶标mRNA;并通过建立慢病毒pri-miRNA载体,检测血管内皮细胞细胞内has-mir-1-2过表达前后miRNAmRNA表达变化。最后通过has-mir-1-2靶标基因Hands2敲除动物模型研究其对主动脉发育异常的影响,以探讨先天性主动脉弓狭窄致病机制中的作用及可能的机制。

                                                   

Congenital heart disease is the most common defect on the birth defect. Its genetic cause remains unknown. We found the fetus with coarctation of the aorta had the gains of 18pter-p11.21 and presume it was related to coarctation of the aorta. On our study we would collected the cases of coarctation of the aorta and normal fetal cases. The CNV were detected by the real-time PCR and the miRNA of the tissue of coarctation of the aorta were detected by miRNA-Seq. The mRNA of tissue on coarctation of the aorta were detected by HITS-CLIP so that compared the differences between the patient and normal cases on the microRNA and RNA. Then cultured the endothelial cell of the aorta by pri-miRNA and detected the changes of the genes on the miRNA and mRNA. At last we investigated the mechanism of coarctation of the aorta through the animal model knockouted of Hands2 gene. It would provided new thinking on the early diagnosis and prevent on the fetal coarctation of the aorta.

(一)立项依据与研究内容4000-8000字):

1项目的立项依据(研究意义、国内外研究现状及发展动态分析,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录);

先天性心脏病是出生缺陷中发病率最高的疾病,在新生儿中发生率约占1[1],是一岁婴儿死亡的首位原因。在严重型先天性心脏病中主动脉弓狭窄(Aortic coarctation)较常见,约占5-8%[2],在活产新生儿中再发机率约1/200[3],常导致患儿心衰[4],严重危害着儿童的健康和生活质量,使得多数怀有先天性主动脉弓狭窄胎儿的夫妻宁愿选择引产放弃胎儿。因此,对先天性主动脉弓狭窄的病因、致病机理的深入研究是疾病早期诊断和预防的重要基础。

(一)多基因遗传病特点是先天性主动脉弓狭窄研究的难点

先天性主动脉弓狭窄是遗传、环境以及遗传和环境相互作用引起的多基因复杂性疾病,其发病因素和致病机理一直是科学家们的研究热点,母体暴露于有害环境因素尤其是在心脏发育的易损期(妊娠2-8周),包括风疹病毒感染、化学致畸因素(维甲酸、锂、高半胱氨酸)、母体疾病(糖尿病、系统性红斑狼疮)等,将导致胎儿心脏发育异常。除了环境因素,遗传因素在主动脉弓狭窄发生中也起着重要的因素,研究表明先天性主动脉弓狭窄遗传率高达58%[3],曾生育先天性主动脉弓狭窄胎儿的孕妇再次妊娠发生先天性主动脉弓狭窄的几率增加,提示先天性主动脉弓狭窄存在明显的遗传易感性。然而先天性主动脉弓狭窄的遗传致病因素至今知之甚少,曾有研究从染色体结构异常对先天性主动脉弓狭窄进行了研究,发现染色体核型异常与先天性主动脉弓狭窄相关[5,6]然而对于绝大多数先天性主动脉弓狭窄患者染色体核型检查并无异常,难以解释染色体核型异常在发病中的关键作用。绝大多数先天性主动脉弓狭窄为散发病例,既没有家族史,又无明显诱因,因此,难以排除众多遗传多态性因素的干扰,发现真正起作用的基因变异。目前仍然没有发现先天性主动脉弓狭窄明确的致病基因,对其发病机制也无确切阐述。

(二)18pter-p11.21染色体拷贝数变异可能是先天性主动脉弓狭窄的关键病因

拷贝数变异(Copy humber vatiations, CNVs)是指基因组中1 kb至几MbDNA片段的缺失和/或扩增。由于其具有分布范围广、可遗传、相对稳定和高度异质性等特点,目前被认为是一种新的可作为疾病易感标志的基因组DNA多态性,其变异引起的基因剂量改变可引起结构表型的改变而导致各种出生缺陷疾病[7],近年CNVs在散发先天性心脏病的作用越来越受到科学家们的广泛关注[8,9],认为其包含的基因拷贝数变异与心脏发育异常具有重要的关系。

我们近期发现夫妻连续两次生育先天性主动脉弓狭窄胎儿病例,胎儿生后1-2天均夭折,孕妇及爱人的家族中均无先天性主动脉弓狭窄患者病史,我们推测一定存在着相同的遗传物质变异决定了这一现象的发生,这也是研究先天性主动脉弓狭窄发病机制的理想病例模型,它为目前先天性主动脉弓狭窄致病机制的研究难题可能提出了新的解决方法:1)可排除环境因素差异对疾病研究的影响;2)对父母和胎儿进行遗传物质的比较,可排除绝大部分繁杂的遗传多态性因素干扰,因此,是研究复杂性多基因遗传病的理想模型。我们前期通过Affymetrix SNP 6.0基因芯片检测了两个患胎的脐静脉血及其父母的外周血样本四个样本,芯片数据信息分析结果显示:两胎拥有部分相同的SNP信号,并且分别与其父亲或母亲信号相匹配,然而同时我们也发现一个非常有趣的现象:两胎与父母相比存在18pter→p11.21 (1,543 bp to 12,438,430 bp)染色体上基因片段拷贝数的增加[10](如图1),其后通过FISH验证了芯片检测结果中显示18pter-p11.2拷贝数增加

     

1  患病胎儿Aarry-SNP检测结果             

这提示先天性主动脉弓狭窄与chr18: 1,543 bp to 12,438,430 bp片段拷贝数增加存在着某种必然联系,然而这个基因片段的拷贝数增加与先天性主动脉弓狭窄到底有什么样的关系呢,我们不得而知,目前对CNVs在先天性心脏病中的致病机理仍属未知[11]

(三)拷贝数变异引起miRNA表达增加可能参与了先天性主动脉弓狭窄的发病机制

我们前期研究中发现先天性主动脉弓狭窄胎儿存在chr18: 1,543 bp to 12,438,430 bp片段拷贝数增加,而在人类遗传性疾病中由染色体拷贝数异常引起的疾病,常见的就是18-三体综合症,发病机制主要是基因组中额外多出一条18号染色体,约95%18-三体综合症患者存在先天性心脏病[12],这是否提示18号染色体上基因片段拷贝数增加与先天性主动脉弓狭窄的发生存在某种必然联系呢?它的变化会引起怎样的分子生物效应呢?这是一个非常值得研究的问题。

人类常见三体综合症中,除了18-三体综合症,常见的就是21-三体综合症,近期研究显示:21-三体综合症患者智力低下是由于21号染色体上基因拷贝数增加,在患者大脑引起相应基因表达的microRNAsmiRNAs)增加,导致靶基因MeCP2mRNA表达抑制,从而产生功能蛋白下降引起了智力低下[13],提示染色体拷贝数增加在病理组织器官可引起相应基因组上的MiRNAs增加,从而抑制靶基因mRNA表达和翻译,降低功能蛋白而产生相应的临床表型,那么chr18: 1,543 bp to 12,438,430 bp染色体拷贝数增加在先天性主动脉弓狭窄的发生中是否也存在相同的致病机理?目前尚属未知。

最新研究表明不但编码区的CNVs可影响基因表达,非编码区的CNVs也可通过基因调控通路影响人类表型[14],通过生物信息工具在人类基因组变异数据库中发现CNVs区域共存在209miRNAs基因(CNVs-miRNAs),人类30%miRNAs位于CNVs区域[15]CNVs可通过空间位置改变影响1Mb距离外转录断点的基因转录,或通过miRNAs介导调控转录通路而影响蛋白相互作用和代谢通路。在孤独症患者的研究中发现11%高频 CNVs富含miRNAs[16],通过CNVs-miRNAs调控MAPK通路是孤独症患者脑部发育异常的重要发病机制。近期研究发现先天性心脏病中也存在高频率的CNVs变异,其中18%CNVs富含miRNA[17],而其中16miRNAs52个目标基因与先天性心脏病密切相关,因此CNVs-miRNAs 可通过影响靶基因mRNA表达和翻译,引起心脏发育相应蛋白和代谢调控通路中的基因剂量失衡,在胚胎主动脉弓狭窄的异常发育中可能起着重要的作用。

MicroRNA是一种大小约为21-23个碱基的单链小分子RNA,已有动物实验研究显示miRNA可通过互补序列结合靶基因3’端非编码区域的靶位点,从而抑制编码蛋白靶基因的翻译和(或)降解靶基因,对心脏的发育起着重要的调控作用[18]我室前期研究显示先天性主动脉弓狭窄胎儿chr18: 1,543 bp to 12,438,430 bp基因片段拷贝数增加,miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk)中查找人类18号染色体具有重要miRNA基因:has-mir-1-2miR-1是心脏组织中表达最丰富的miRNAmiR-1过度表达通过碱性螺旋--螺旋结构抑制对心脏发育具有重要影响的转录因子Hand2,对胚胎心脏早期发育具有重要作用[19]。因此,我们推测chr18: 1,543 bp to 12,438,430 bp染色体拷贝数的增加,在心脏组织产生了相应基因片段上的has-mir-1-2过渡表达,导致与心脏发育有重要作用的靶基因Hands2的表达下调,通过影响蛋白代谢和/或基因调控通路的基因剂量失衡参与了先天性主动脉弓狭窄的异常发育。

基于以上分析,本研究拟收集先天性主动脉弓狭窄胎儿、正常胎儿(无生育指标引产胎儿)的脐静脉血、主动脉弓血管组织样本,通过Real-time PCR检测脐静脉血、病变组织中chr18: 1,543 bp to 12,438,430基因片段拷贝数,验证先天性主动脉弓狭窄患者存在的染色体拷贝数差异,采用miRNA-Seq检测主动脉弓血管组织的miRNA差异,然后通过HITS-CLIP检测先天性主动脉弓狭窄差异miRNA的靶标mRNA;并通过建立慢病毒pri-miRNA载体,检测血管内皮细胞细胞内has-mir-1-2过表达前后miRNAmRNA表达变化。最后通过has-mir-1-2靶标基因Hands2敲除动物模型研究其对主动脉发育异常的影响,以探讨基因拷贝数增加引起miRNA过表达在先天性主动脉弓狭窄致病机制中的作用及可能的机制,为先天性主动脉弓狭窄的早期诊断和预防提供新的研究思路。

参考文献

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10Hua Hu, Jia hao, Hong Yao, Qing Chang,Rui Li, Xiaohang Zhang, Zhiqing Liang. Prenatal diagnosis of de novo partial trisomy 18p and partial monosomy 18q recurrent in a family with fatal aortic coarctation. Gene, 2013(1), 517: 132-136.

11Zhao W, Niu G, Shen B, Zheng Y, Gong F, Wang X, Lee J, Mulvihill JJ, Chen X, Li S. 2013. High-resolution analysis of copy number variants in adults with simple-tomoderate congenital heart disease. Am J Med Genet Part A 161A: 3087–30

12夏家辉,李露芸. 染色体病. 科学出版社, 1989:197.

13Kuhn DE, Nuovo GJ, Terry AV Jr. Chromosome 21-derived microRNAs provide an etiological basis for aberrant protein expression in human Down syndrome brains. J Biol Chem. 2010, Jan 8; 285(2):1529-43.

14Harsh Dweep, George D. Georgiou, Norbert Gretz, Constantinos Deltas, Konstantinos Voskarides, Kyriacos Felekkis. CNVs-microRNAs Interactions Demonstrate Unique Characteristics in the Human Genome. An Interspecies in silico Analysis. PLOS ONE, 2013, Volume 8(12): 1-7

15Stephan Persengiev, Ivanela Kondova and Ronald Bontrop. Insights on the functional interactions between miRNAs and copy number variations in the aging brain, Frontiers in Molecular Neuroscience. 2013, October, Volume 6: 1-8

16Vaishnavi,V., Manikandan,M., Tiwary, B.K., and Munirajan,A.K. (2013). Insights on the functional impact of microRNAs present in autism-associated copy number variants. PLoS ONE 8: e567-81.

17H.-J. XING, Y.-J. LI1, Q.-M. MA, A.-M. WANG, J.-L. WANG, M. SUN, Q. JIAN, J.-H. HU, D. LI, L. WANG.. Identification of microRNAs present in congenital heart disease associated copy number variants. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2013; 17: 2114-2120

18Esteller M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews 2011, 12:861–874.

19Jinghai Chen and Da-Zhi Wang. microRNAs in cardiovascular development. J Mol Cell Cardiol. 2012, 52(5): 949–57.

2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题(此部分为重点阐述内容)

1研究目标:

本研究的目标是:以chr18: 1,543 bp to 12,438,430基因片段拷贝数增加为切入点,探讨染色体基因拷贝数变异引起microRNA变化在先天性主动脉弓狭窄发病机制中的作用及可能的机制。

①研究先天性主动脉弓狭窄胎儿在外周血、主动脉弓血管组织标本中存在的chr18: 1,543 bp to 12,438,430基因拷贝数差异、has-mir-1-2mRNA的差异;

②研究先天性主动脉弓发育相关has-mir-1-2过表达对胚胎主动脉发育功能影响和意义;

③探讨CNVs-miRNA-mRNA在先天性主动脉狭窄致病机制中的作用及可能的机制。

2)研究内容:

①在伦理学原则和知情同意原则下收集先天性主动脉弓狭窄胎儿和心脏发育正常胎儿(无生育指标要求引产)标本,包括胎儿血液样本、主动脉弓血管组织样本,分组入液氮罐冻存,分别提取和分离血液和组织样本的DNAmRNAmiRNA主动脉弓血管组织蛋白,-20度冻存;

②采用Real-time PCR检测血液样本、主动脉弓血管组织样本DNAchr18: 1,543 bp to 12,438,430基因拷贝数,比较先天性主动脉弓狭窄组和心脏正常胎儿组间存在的基因拷贝数差异;

③通过miRNA-seq检测主动脉弓血管组织中has-mir-1-2,比较先天性主动脉弓狭窄组和正常组主动脉弓血管组织中microRNA的差异;

采用HITS-CLIP检测先天性主动脉弓狭窄相关差异has-mir-1-2的靶标mRNA

⑤血管内皮细胞体外培养,以慢病毒为过表达载体,插入pri-miRNA,建立has-mir-1-2的过表达模型,通过体外功能实验确定microRNA过表达在心脏细胞中的调控作用

建立has-mir-1-2的靶标基因Hands2敲除转基因动物模型,通过转基因动物心脏结构发育的变化,研究该变异对胚胎主动脉发育的功能影响;

⑦探讨染色体拷贝数增加引起microRNA过表达,从而抑制功能基因mRNA表达在先天性主动脉弓狭窄致病机制中的作用及可能的机制。

3拟解决的关键科学问题:

18p11.21染色体拷贝数变化导致相应microRNA表达增加,引起相关mRNA表达抑制与先天性主动脉弓狭窄发病机制的关系。

②保证病例收集者、实验操作者和数据分析者三盲是提高实验结果论证强度的关键,同时多组样本的实验数据处理,将得到较多的实验数据,采取合适的生物信息学方法进行合理的数据分析,是最终得到真实、可信的实验结果的另一关键所在。

3拟采取的研究方案及可行性分析(包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明);

1)总技术路线:

文本框: MiR-Seq 检测血管组织has-mir-1-2文本框: Real-time PCR检测基因拷贝数变异

文本框: HITS-CLIP检测has-mir-1-2靶基因mRNA文本框: MiR-Seq 检测血管组织has-mir-1-2-文本框: Realtime PCR检测 mRNA变化

文本框: 慢病毒转染过表达has-mir-1-2文本框: Real-time PCR检测基因拷贝数变异

文本框: Western Blot检测蛋白水平

2)实验方案

①病例收集:先天性主动脉弓狭窄胎儿来自我院产前诊断中心出生缺陷胎儿标本库,筛选其中经过中孕期系统彩超+胎儿心脏彩色多普勒检查确诊为先天性主动脉弓狭窄病例。心脏发育正常胎儿为无生育指标要求引产、且心脏经超声心动图检查为正常胎儿。经家属要求入院引产,签引产知情同意书、尸检同意书、组织标本留取同意书等。

②样本收集:包括组织样本收集和临床资料收集。样本收集包括胎儿脐带静脉血液标本、主动脉弓血管组织标本,脐血标本存放-20℃冰箱备用,心脏肌肉标本取材后立即置于液氮中保存备用;临床资料收集包括制定并填写临床病例信息表格,包括孕妇孕周、孕产史、不良物质接触史、家族史、胎儿性别、中孕期胎儿系统彩超和胎儿心脏彩色多普勒检查结果等。将以上样本分为先天性主动脉弓狭窄组和心脏发育正常组。收集先天性主动脉弓狭窄引产胎儿10例,心脏发育正常组10例,并根据孕周、性别对标本进行匹配。

③标本DNAmicroRNAmRNA提取:按血液基因组试剂盒提取血液基因组DNA,琼脂糖电泳检测,并用N-100全波长分光光度计测量浓度和纯度;主动脉弓血管组织提取按照试剂盒标准程序进行(Invitrogen),电泳检测RNA完整性,-80℃保存备用。

18p11.21染色体拷贝数检测:设计引物,采用Real-time PCR检测两组血液标本中染色体拷贝数片段,比较两组差异。

⑤miR-Seq的检测

A、测序文库构建:纯化miRNA,连接酶接头,链接5RNA接头,链接3RNA接头, RT-PCR获得cDNA测序文库,高保真聚合酶扩增构建的测序文库;

B、高通量测序:DNA成簇扩增,采用illumina Genome analyzer进行高通量测序;

C、数据分析:原始数据读取,找出各个标本组之间的差异表达microRNA,包括has-mir-1-2分析利用TargetScan数据库关联microRNA的靶基因(http://www.targetscan.org,进行microRNA和靶基因的预测;

DGO功能显著性富集分析靶基因;

EPathway显著性富集分析靶基因;

FmicroRNA调控的靶基因,信号通路分析,集中于细胞连接、突触突触、细胞骨架信号通路。

采用HITS-CLIPhigh-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation)检测先天性主动脉弓狭窄差异miRNA的靶标mRNA

A、 先天性主动脉弓狭窄相关microRNA所调控靶基因的预测:应用生物学信息靶基因预测[MICRORNADA(http://www.microran.org/miranda_new.html)TARGETSCAN(http://genes.mit.edu/targetscan/) PICTAR(http://pictar.bio.nyu.edu/) ]等对CHD相关microRNA所调控靶基因进行预测;

B、 紫外线照射细胞使RNA与直接接触的蛋白质复合物共价结合,用核糖核酸酶A消化AGO 表面的RNA

C、 经去磷酸化后接上3'RNA接头,再经磷酸化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNAPCR扩增并测序;

D、 通过序列剪切、序列过滤前后的序列计数和序列长度分布,进行数据过滤和数据分析;

has-mir-1-2过表达血管内皮细胞模型

A、 培养血管内皮细胞,针对has-mir-1-2序列,构建慢病毒表达载体,转染前一天,接种0.4-1.0X105血管内皮细胞/孔至24孔板中,加入血清培养液,培养至40-70%融合;Option-MEMI培养液稀释DNA,并与RNAi-Mate混匀,形成DNA-Mate混合物,再将混合物加入含细胞的培养板中,使混合物均匀覆盖细胞

B、 细胞培养24-48h后,除去复合物,更换培养基,通过表达绿色荧光蛋白的DNA载体检测细胞转染效率,计算转染率;

C、 同时建立对照细胞株,包括载体阴性对照组(可以表达与目的基因序列无同源性的miRNA片段)、转染试剂对照组;

D、 采用Realtime-PCR检测has-mir-1-2mRNA水平,比较has-mir-1-2过表达组与对照组细胞has-mir-1-2差异及mRNA差异。

统计分析:标本分为正常组和先天性主动脉弓狭窄组,采用SPSS15.0软件对各组(包括正常组和12个先天性主动脉弓狭窄组)染色体片段拷贝数、microRNAmRNA进行统计学分析。比较各之间三个参数在性质和数量上的差异。

⑨通过制备miRNA过表达转动物小鼠研究拷贝数变异对主动脉弓发育的功能影响;

A、设计Hands2突变基因的转基因载体,构建转基因小鼠模型;

BNorthern blottingRT-PCR检测转基因小鼠中miRNA基因前体的表达情况;;

C、动物模型检测:尸检表型观测,Elisa,病理切片。

探讨染色体拷贝数变异引起microRNA变化,从而抑制功能基因mRNA表达在先天性主动脉弓狭窄致病机制中的作用及可能的机制。

3)可行性分析

①理论可行性:最近研究表明心脏发育与CNVsmicroRNA具有密切关系,因此,从CNVs变异角度探讨microRNA变化在先天性主动脉弓狭窄中的发病机制是有理论依据的。虽然我们不能把所有先天性主动脉弓狭窄都归咎于microRNA,但染色体拷本数增加所致microRNA过表达增加,而抑制功能基因的表达为复杂性先天性心脏病研究提供了新的思路。

②样本可行性: 多年来我们产前诊断中心建立了胎儿标本库,包括引产胎儿脐带静脉血、病变组织样本等,标本在患者知情同意和伦理学原则下收集,目前已保存胎儿血液、组织标本上百例,其中先天性主动脉弓狭窄胎儿血液样本20例,血管组织标本9例,发育正常胎儿样本(无生育指标引产)8例。

③技术和设备可行性:课题负责人及课题组成员均为长期工作在科研一线的中青年科技人员,分别有基因组DNA检测技术、microRNAmRNA检测技术方面的专业人员,本单位与华大基因已建立联合实验室,可在miRNA深度测序方面提供技术支持;同时转基因动物模型可在国内转基因成熟的商业化公司进行(如广州赛业公司)。项目依托单位拥有本项目所需的绝大部分仪器,所需试剂均已商品化,国内均能购买,为本项目的完成提供了硬件和软件的保证。

4本项目的特色与创新之处;

1临床发现特殊病例为我们提供了研究复杂性先天性心脏病提供了理想研究模型;

2)先心病是近十年出生缺陷研究热点,基于基因组序列差异之外的CNVs-miRNA角度寻找先天性主动脉弓狭窄的致病基因和发病机理可能为探索先天性主动脉弓狭窄发病的分子机制提供新的研究思路。

5年度研究计划及预期研究结果(包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等)。

1)年度研究计划:

2015.1-2015.03

A、 进一步完善最新研究进展文献、样本的收集;

B、 实验试剂的定购。

2015.04-2016.04

A、 完成各样本DNA的提取,并进行染色体拷贝数检测,并比较各组差异;

B、 检测各组样本microRNA,并比较各组差异;

2016.04-2017.04

A、检测各组样本mRNA,并比较各组差异;

B、统计分析各组之间染色体拷贝数、microRNAmRNA的差异和相关性。

2017.04-2017.12

A、 综合分析研究所得的实验结果;

B、 撰写论文和研究总结报告。

2)预期研究成果:

①获得用于先天性主动脉弓狭窄产前诊断的新指标;同时可能为先天性主动脉弓狭窄治疗和预防提供新的思路。

②研究结果将以论文形式在国内外影响因子较高的学术期刊上发表(2-3篇),并积极申请科研成果奖励和专利。

③通过该项目的实施和完成,培博士生和硕士生2-3名,促进依托单位科研队伍的建设,推动学科发展。

(二)研究基础与工作条件

1工作基础(与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩);

第三军医大学第一附属医院妇产科是全军计划生育技术中心、产前诊断中心、基因诊断中心,近5年内先后获国家自然科学基金资助项目16项,十一五国家支撑计划项目2项,“十一五”863计划“生物芯片仪器和试剂”课题之“染色体遗传病高通量检测芯片”子课题,重庆市自然科学基金3项,发表SCI及统计源期刊论文160余篇,获军队科技进步二等奖和三等奖各2项,重庆市科技进步二等奖1项。

1)产前诊断中心长期开展遗传病产前咨询和诊断、胎儿中孕期系统超声检查、胎儿MRI、引产胎儿尸检等,已形成较为成熟的出生缺陷检测流程,常期进行羊膜腔穿刺、脐静脉穿刺、宫腔取绒毛、细胞核型分析、标本库建立等。

2) 已建立完善的围生期出生缺陷随访系统、出生缺陷临床诊治资料库和生物标本库,系统地进行了出生缺陷疾病的临床资料、疾病监控、产前诊断、预后随访等一系列规范化的管理,为出生缺陷的发病率、发病机制、临床处置、疾病预后等研究供了完善的研究资料,同时建立了出生缺陷生物标本库,通过临床标本数据库进行专人录入和管理,收集了胎儿出生缺陷的临床资料和各类样本,包括先天性心脏病患儿的血液、组织、胎盘、DNARNA等标本的保存,同时创建了系列病理样本制作技术,建立了国内最大的胎儿先天畸形标本库。

3)本课题组长期致力于先天性心脏病发病机制方面的研究,发表SCI论文3篇:

2010年,发现基因DAAM1单拷贝数缺失和GATA6拷贝数重复与先天性心脏发育异常具有重要联系,在BMC Med Genet发表SCI论文1篇(请见申请者简历)。

2011年课题组研究了双胎之一患有先天性主动脉弓狭窄的胎儿与父母、另一胎儿之间存在18p11.21染色体上三个基因片段拷贝数的差异,其后通过Real-time PCR再次验证了双胎及父母标本中芯片检测结果显示的拷贝数差异,在Gene发表SCI论文1篇。

2012年课题组研究发现先天性心脏病是多基因遗传性疾病,染色体变异(18三体、21三体、45单体)是先天性心脏病最常见的致病原因,同时我们发现染色体拷贝数也是先天性心脏病重要的致病因素,在Int. J. Biol. Sci发表SCI论文1篇。

2013年课题组研究发现,相关SCI论文正在撰写中。

2工作条件(包括已具备的实验条件,尚缺少的实验条件和拟解决的途径,包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况);

第三军医大学第一附属医院全军计划生育优生优育技术中心、产前诊断中心、基因诊断中心,为博士培养学科,现有博士导师2人,硕士导师6人,科研基础和科研实力强大,近5年内先后获国家自然科学基金资助项目16项,十一五国家支撑计划项目2项,“十一五”863计划生物芯片仪器和试剂课题之染色体遗传病高通量检测芯片子课题,重庆市自然科学基金3项,发表SCI及统计源期刊论文160余篇,获军队科技进步二等奖和三等奖各2项,重庆市科技进步二等奖1项。遗传疾病的产前诊断一直是我科研究的重点方向,主要研究领域包括:无创分离富集胎儿细胞的微阵列细胞分选芯片的设计,用于DMD的基因诊断取得了良好的结果;通过芯片毛细管电泳技术平台建立了地中海贫血等单基因遗传病的高灵敏度检测方法。因此,我们已经建立了具有相当条件的分子遗传学平台,并与深圳华大研究中心建立了良好的合作关系,为我们开展进一步的研究提供了强大的后备技术保障。本产前诊断中心为重庆首批批准通过的产前诊断中心,多年来门诊常规开展出生缺陷产前筛查,建立胎儿出生缺陷标本库收集并保存了1000多例各种先天性心脏病样本,包括主动脉弓狭窄样本30多例。因此,依托本实验室可开展本项目的绝大部分实验研究工作。本实验室所设计的试剂药品均已实现商品化,如DNAmRNA提取、组蛋白乙酰化检测试剂盒等。

3承担科研项目情况(申请人和项目组主要参与者正在承担的科研项目情况,包括国家自然科学基金的项目,要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等);

无正在承担的科研项目。

4完成国家自然科学基金项目情况(对申请人负责的前一个已结题科学基金项目(项目名称及批准号)完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要(限500字)和相关成果的详细目录)。

<项目名称> a-珠蛋白基因甲基化对HbH病表型修饰的作用机理研究(批准号:30901619        起止时间:2010.1-2012.12

完成情况:已顺利结题,发表文章5篇,包括SCI文章1篇。

本课题研究中发现a-globinIGSF基因的甲基化水平差异在地中海贫血的发病中起着重要的调控作用,其可能成为将来地中海贫血产前诊断和基因治疗新的切入点。与本项目关系:中心主要研究各种出生缺陷疾病,前一个课题已圆满结题,为本课题建立了出生缺陷疾病的研究奠定了坚实的分子研究技术平台。

项目结题摘要:

本研究通过甲基化芯片检测轻度地中海贫血和重度地中海贫血血样基因启动子CpG岛甲基化水平,筛选在轻度地中海贫血和重度地中海贫血血样中存在显著变化的基因共209条;然后采用Pathway与相关疾病分类,筛选出11条有甲基化变化、且与血液病及遗传病直接相关的基因;同时我们采用了表达谱芯片分别筛选在中重度HbH病血样和轻度HbH病血样中存在显著变化的基因,进行分层聚类分析,并使用TREEVIEW软件查看,可见两者差异表达基因共251条,其中上调基因159条和下调基因92条。根据分层聚类分析将23例重度HbH病地中海贫血和5例轻度HbH病对照血样完全分开,聚类结果显示IGSF4基因启动子区甲基化程度已经成功将重度HbH病和轻度HbH病外周血区分成两部分。经MassARRAY甲基化质谱测序对比分析,结果显示a-globin基因启动子区的12CpG位点在重度地中海贫血中相对于轻度HbH病外周血甲基化程度明显增高。然后采用实时定量RT-PCR检测a-珠蛋白基因mRNAIGSF4基因实时定量PCR验证结果显示,该基因在中重度HbH病中呈低表达。其后采用了DNA甲基转移酶抑制剂体外培养重症HbH病红系前体细胞,采用实时定量RT-PCR检测a-珠蛋白基因mRNA,显示抑制剂培养后的细胞较培养前IGSF4基因、a-globin基因表达增高,以上结果提示IGSF4基因启动子甲基化、a-globin基因启动子区的12CpG位点a-珠蛋白基因的甲基化调控参与了HbH病表型的修饰作用。

相关成果目录:

1. Gao T, Nie Y, Hu H, Liang Z. Hypermethylation of IGSF4 gene for noninvasive prenatal diagnosis of thalassemia. Med Sci Monit. 2012 Jan; 18(1):BR33-40.

2. 胡华,包碧惠,姚宏,常青,徐刚,胡斌,梁志清. HbH病产前筛查与妊娠结局的影响因素研究.中国优生与遗传杂志2011,1019):66-67

3. 胡华,姚宏. 中重度珠蛋白生成障碍性贫血的治疗进展. 分子诊断与治疗杂志,201092):357-360

4. 高天,梁志清,聂艳丽,朱虹琳,吴伟静,胡华. 利用寡核苷酸芯片诊断α-地中海贫血的无创方法的探讨. 重庆医学,200938(22)2827-2830.

5. 高天,梁志清,聂艳丽,张亮,朱虹琳,吴伟静,胡华. HDAC3基因在β-地中海贫血中甲基化状态及其意义研究. 重庆医学,200938(23)2957-2959.

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