张自强* 刘玉梅 朱雪敏 位兰 黄婷婷 张春燕

（河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003）

摘要：目的  观察6-苄氨基嘌呤对四氯化碳致小鼠肝脏氧化损伤的保护作用。方法   用灌胃法，小鼠连续7 d给予20、40mg/kg的6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）。第7 d经腹腔单次注射四氯化碳（CCl₄）诱发小鼠肝脏氧化损伤。24 h后用分光光度计测定各组小鼠肝脏组织总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力和丙二醛（MDA）含量；制作石蜡切片，观察小鼠肝细胞形态结构的变化；用单细胞凝胶电泳法检测肝细胞中DNA氧化损伤水平。结果  与对照组相比，CCl₄组小鼠肝脏组织的T-SOD、GSH-Px活力显著降低，而MDA含量显著升高。20、40 mg/kg的6-BA预处理组能显著抑制CCl₄诱导的小鼠肝脏组织MDA含量升高，并升高T-SOD和GSH-Px活力。CCl₄组小鼠出现肝细胞索排列紊乱，中央静脉淤血，细胞肿胀、空泡变性等一系列病理变化。单细胞凝胶电泳显示，CCl₄组小鼠出现明显扫帚状尾巴。6-BA预处理组能明显改善CCl₄诱发的形态变化，以及降低细胞彗尾长度。结论   6-苄氨基嘌呤对CCl₄致小鼠肝脏氧化损伤具有一定的保护作用。

关键词：6-苄氨基嘌呤；肝脏；氧化损伤

中图分类号：R962                             文献标识码：A

The protective effects of 6-benzylaminopurine against oxidative damage in liver tissue of mice induced by CCl₄

ZHANG Zi-qiang, LIU Yu-mei, ZHU Xue-min, WEI Lan, HUANG Ting-ting, ZHANGChun-yan

College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China

Abstract:  Objective  To study the protective effects of 6-benzylaminopurine (6-BA) on oxidative injury in mice liver induced by CCl₄. Methods  Mice were administrated by 6-BA (20,40 mg/kg) by gavage once daily for 7 days. After the last administration of 6-BA, hepatic injury was induced by once intraperitoneal injection of CCl₄. After 24h, the activities of T-SOD, GSH-Px, and the content of MDA were detected by spectrophotometer. Histological features of mice liver were observed by paraffin section and DNA oxidative damage were measured by single cell gel electrophoresis method. Results Compared with control group, CCl₄ treatment significantly decreased the activities of T-SOD, GSH-Px, and increased the levels of MDA. Pretreatment of 6-BA inhibited significantly MDA generation and increased the activities of T-SOD and GSH-Px. Microscopical examination of the liver showed that a series of pathological change were observed in mice treated by CCl₄, such as disorganized hepatocyte cord, blood clot in central veins, cellular swelling, vacuolar degeneration and so on. The result of single cell gel electrophoresis showed that there were significant broom shaped tails. Pretreatment of 6-BA could significantly improve morphology and DNA damage induced by CCl₄. Conclusion  6-BA has protective effects against oxidative damage in liver tissue of mice induced by CCl₄.

Key words: 6-benzylaminopurine; liver; oxidative damage

肝脏参与机体消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程，是体内代谢极为活跃的重要脏器之一，因此，肝脏的耗氧量大，产生的氧自由基多^[1]。另一方面肝脏在药物的代谢或处置过程中发挥重要作用，许多药物和毒物经细胞色素P450氧化后可形成不成对的电子的代谢物，即自由基，容易在肝内积聚^[2]。肝内产生过多的自由基，将会造成氧化损伤，而氧化应激是许多肝脏疾病的共同发病机制。6-苄胺基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）是植物生长调节剂中细胞分裂素的一种，被广泛应用于植物组织培养、果实生长及蔬菜保鲜等^[3]。文献报道，许多植物细胞分裂素具有抵抗动物细胞氧化衰老的功效^[4,5]。但是6-BA对动物及人体的某些组织细胞是否具有防御氧化损伤功能还未见报道，本文采用四氯化碳（CCl₄）致小鼠肝脏损伤，观察不同浓度的6-BA抑制小鼠肝脏氧化损伤的效果。

材料与方法

1 材料

动物   健康昆明系小白鼠80只，雄性，体重（20.0±2.0）g，购自河南科技大学动物科技学院实验动物中心。实验前饲养一周以适应环境，室温（24±2）℃、湿度40%-60%，自由采食和饮水。

药品与试剂   6-苄氨基嘌呤（6-BA），购于厦门星隆达化学试剂有限公司，由美国Sanland公司生产，用0.06mol/L的盐酸配制成1000 mg/L、2000 mg/L的储备液；丙二醛（MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒和考马斯亮兰试剂盒，均为南京建成生物工程研究所生产。

仪器  RM 2235型生物组织切片机，德国Leica；UV-6300型分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；BX41TF荧光显微镜，日本Olympus公司产品；DYY-11型电泳仪，北京六一仪器厂；DYCP-33A电泳槽，北京六一仪器厂。

2 实验方法

2.1小鼠分组及处理

小鼠适应环境1周后，随机将其分为4组，每组20只，具体处理方法如下，对照组（control group），灌胃0.06 mol/L盐酸0.4 ml，每天一次，连续一周，末次灌胃2 h腹腔注射溶剂油溶液（新鲜无菌植物油）0.2 ml，随后动物禁食。模型组（model group），灌胃0.06 mol/L盐酸0.4 ml，每天一次，连续一周，末次灌胃2 h腹腔注射3.2% CCl₄的注射溶剂油溶液（新鲜无菌植物油）0.2 ml，复制小鼠肝脏组织氧化损伤模型。6-BA低剂量保护组，灌胃1000 mg/L 6-BA药液0.4 ml，给药剂量为20 mg/kg.bw，每天一次，连续一周，末次灌胃2 h腹腔注射3.2% CCl₄油溶液（新鲜无菌植物油）0.2 ml。6-BA高剂量保护组：灌胃2000 mg/L 6-BA药液0.4 ml，给药剂量为40 mg/Kg.b.w，每天一次，连续一周，末次灌胃2 h腹腔注射3.2% CCl₄的注射溶剂油溶液（新鲜无菌植物油）0.2 ml。

2.2待测样本采集和处理

相应处理结束后，禁食24 h后从每组随机抽取10只小鼠，脱颈椎处死。取出肝组织，用冷生理盐水漂洗后制成10%的肝匀浆，离心，取上清液，准备检测各项指标；另每组随机抽取3只小鼠，准备制作肝脏石蜡切片；再每组随机抽取3只小鼠，准备制作肝脏单细胞悬液以检测小鼠肝脏组织DNA损伤。

2.3总蛋白的测定

按说明书的要求，在测定抗氧化酶和MDA之前，先测定10％肝匀浆的总蛋白含量，以考马斯亮兰法，用紫外可见分光光度计在540 nm处测定各管吸光度（A）值，按下列公式计算各管的蛋白含量。

蛋白含量（g/L）＝（测定管A值/标准管A值）*标准管浓度（g/L）

2.4 T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量测定

取10%肝脏组织匀浆，用生理盐水稀释成1%组织匀浆后通过黄嘌呤氧化酶法参照试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在550 nm处比色，测定吸光度，计算T-SOD活力。取10%肝脏组织匀浆用生理盐水稀释成0.8%的匀浆液后，参照试剂盒说明，通过DTNB法参照试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在412 nm处比色，测定吸光度，计算GSH-Px活力。取10%肝脏组织匀浆用生理盐水稀释成5%匀浆液后通过TBA法参照试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在532 nm处比色，测定吸光度，计算MDA活力。

2.5 组织切片的制作

取小鼠肝脏组织，截取3 mm×4 mm大小方形块，放在10%甲醛溶液中固定24～48 小时。随后经冲洗、脱水、透明、浸腊和包埋后，用切片机做连续冠状切片，厚度7~8 μm。之后脱蜡行HE染色，再经脱水封片后用显微镜观察并拍照。

2.6 单细胞凝胶电泳法测定DNA氧化性损伤

取小鼠肝脏组织置于PBS液中，用玻璃匀浆器制作单细胞悬液，放入4℃冰箱中保存备用。取50℃水浴中保存的0.75%的正常熔点的琼脂糖100 μl铺于全磨砂载玻片上放入37℃烘箱过夜烘干后作为底层胶；再取上述琼脂糖110 μl加在底胶上，水平放于4℃冰箱中保存20 min至凝固作为第二层胶；吸取70 μl制备好的单细胞悬液和140 μl在37℃水浴中保温的0.65%的低熔点琼脂糖混匀，吸取混匀液110 μl滴加在第二层胶上，水平放于4℃冰箱中保存20 min至凝固作为第三层胶。将制备好的胶板浸入细胞裂解液，4℃裂解1 h，然后置于电泳槽中加入电泳液，4℃解旋25 min，电泳20 min（20 V，200 mA）。电泳结束后加入中和液中和15 min，然后滴加10 mg/L的EB水溶液40 μl，染色10 min。在暗室中用荧光显微镜，绿色（波长550 nm）荧光下观察并拍照。每组随机选取3张胶片，每张在10×10倍镜下随机选取8个视野，将彗星尾长>35 μm视为拖尾，统计每组细胞彗星拖尾率。 

3 数据分析

试验结果均以X±SD表示，并采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，组间差异显著性采用Duncan检验法。

结果

1 6-BA对CCl₄肝损伤小鼠肝脏T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响

各组小鼠肝组织匀浆后T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量的测定结果见表1。与对照组相比，模型组小鼠T-SOD、GSH-Px的活力显著降低，MDA含量显著升高，证实模型复制成功。低剂量和高剂量6-BA组小鼠肝组织T-SOD和GSH-Px的活力均显著高于模型组，表明6-BA具有保护CCl₄肝损伤小鼠肝脏组织抗氧化酶活力降低的功能。低剂量和高剂量6-BA组小鼠肝组织MDA含量分别为1.44，0.96 nmol/mg prot，比模型组（1.78 nmol/mg prot）分别降低了19.1%和46.07%，证实6-BA对机体内CCl₄肝损伤小鼠肝脏组织脂质过氧化终产物的生成有较强的抑制作用。

表1 6-BA对CCl₄肝损伤小鼠肝脏T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响Table 1 Effects of 6-BA on T-SOD, GSH-Px activity and MDA content in CCl₄ induced liver injury mice liver

Mean±SD, n=10; Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, ^△P<0.05

2 6-BA对CCl₄肝损伤小鼠肝脏组织形态结构的影响

图1所示，对照组肝细胞排列有序，染色均匀，细胞浆无深染、无空泡，细胞核无消失以及融合等表现。模型组（CCl₄）小鼠出现肝索排列紊乱，中央静脉出现明显淤血，肝细胞大面积肿胀、空泡变性，部分细胞核碎裂以及溶解消失。6-BA低剂量组肝细胞索结构基本完整，个别细胞出现肿胀、核深染以及核消失现象。6-BA高剂量组肝细胞索结构清晰完整，损伤轻微，核结构与对照组无明显差异。

图1 6-BA对CCl₄肝损伤小鼠肝脏组织形态结构的影响（×400）

Figure 1 Effects of 6-BA on morphology in CCl₄ induced liver injury mice liver (×400)

3 6-BA对CCl₄肝损伤小鼠DNA氧化损伤的影响

各组小鼠肝脏组织单细胞电泳后荧光图像见图2。由图2可知，对照组无拖尾，头部为一明亮的圆球，边缘光滑，荧光较强。模型组（CCl₄）出现明显扫帚状拖尾。6-BA低剂量和高剂量组细胞彗尾长度明显变短。各组小鼠彗尾长度的统计结果见表2。由表2可知，与对照组相比，模型组细胞彗尾长度显著升高。6-BA低、高剂量组细胞彗尾长度分别比模型组显著降低了40.31%和70.49%，证实6-BA对机体内CCl₄肝损伤小鼠DNA损伤有较强的抑制作用。

图2 小鼠肝脏组织单细胞电泳后荧光图像

Figure 2 Fluorescence image of mice liver after single cell electrophoresis

表2 6-BA对CCl₄肝损伤小鼠彗星尾长的影响

Table 2 Effects of 6-BA on comet tail length in CCl4 induced liver injury mice liver

Mean±SD, n=3; Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, ^△P<0.05

讨论

在有机体的生命活动过程中，自由基的产生、淬灭、利用和损伤是几乎同时进行的对立统一过程。生理状况下，机体内氧自由基的产生和清除处于动态平衡状态，动物体内有一套完整的防御系统来保护机体不受自由基的侵害。但在病态和衰老的情况下，机体不能有效清除产生的氧自由基，这些过剩的自由基主要通过脂质过氧化作用损伤蛋白质与核酸等生物分子致使组织损伤而发生疾病。肝内产生过多的自由基，将会造成氧化损伤，而氧化应激是许多肝脏疾病的共同发病机制^[6]。如环境刺激物及代谢应激物通过对肝细胞线粒体的损伤产生自由基，在细胞因子等共同作用下引发脂肪性肝炎；而病毒性肝炎患者的肝脏中促氧化/抗氧化系统处于严重失衡状态。因此，肝脏氧化损伤是动物和人体所面临的一个非常常见和严重的问题，它可引起动物和人体的衰老和其他疾病的发生，加重机体的衰老和病变。

6-BA具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，具有稳定、廉价和易于使用等特点，且是一种对人、畜安全的植物生长调节剂，因此广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。资料表明，许多植物生长调节剂不但能够促进植物的生长而且还能预防动物组织的氧化损伤和抵抗衰老。如，6-糠氨基嘌呤能够抑制动物肝^[7]和卵巢^[8]等组织器官的氧化应激，甚至能够提高衰老大鼠的免疫功能^[9]。而6-BA化学结构与6-糠氨基嘌呤十分相似，且其在植物方面的抗氧化损伤和抗衰老的作用非常明显，是否6-BA也对动物组织具有抗氧化能力，目前未见报道。由此，本实验室应用CCl₄腹腔注射小鼠制作肝脏氧化损伤模型，并预先采用6-BA进行保护，结果证实6-BA能够有效抑制CCl₄诱发的小鼠肝脏抗氧化酶活力降低和脂质过氧化产物积累，同时6-BA也能够抑制CCl₄引发的小鼠肝脏DNA损伤。这些结果提示，6-BA对CCl₄诱导的小鼠肝脏氧化损伤具有保护作用，但详细机制还有待于我们进一步探讨。

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