上海市科学技术委员会
科研计划项目课题可行性方案
课题名称 膜—细胞骨架联接蛋白ezrin及骨架蛋白F-actin对肝癌生长和转移的影响
一、 趋势判断和需求分析
肿瘤转移是恶性肿瘤最基本的生物特征，是一系列具有内在联系的多个步骤相互作用的结果，其中包括肿瘤细胞的侵袭、迁移、种植等，每个步骤又是由多个因素的共同参与的，因而其具有复杂性。它是目前肿瘤患者死亡的主要原因，因此，对肿瘤转移的研究是肿瘤学研究中最受关注的前沿之一。
肿瘤细胞信号转导与肿瘤转移密切相关，c-Met基因曾被认为是肿瘤发生发展的促癌因素之一，在国家自然科学资助课题中（39970290），我们通过sf/hgf基因转染低转移潜能的肝癌细胞系（SMMC7721）得到高转移潜能的SF7721细胞系。我们观察到SF/HGF-c-met(scatter factor/hepatocyte growth factor-c-met癌基因)通路的激活对肿瘤转移有着几乎全过程的作用，尤其存在SF/HGF自分泌、SF/HGF-c-met自我激活的肿瘤，具有高度转移的倾向(1)。我们利用c-Met癌基因反义寡核苷酸链，c-Met反义核酸质粒及U1SnRNA/核酶/反义c-Met复合体质粒转染肝癌SF7721细胞系，对c-Met进行转录水平上的封闭并对比转染前后其生长的变化。研究结果发现，肿瘤细胞的生长受到抑制。c-Met癌基因反义寡核苷酸链，c-Met反义核酸质粒及U1SnRNA/核酶/反义c-Met复合体质粒可以使细胞成瘤潜伏期延长，实验组动物饲养35天后，瘤重明显低于对照组。但由于SF/HGF-c-met信号通路网络复杂，以及SF/HGF自分泌、SF/HGF-c-met自我激活现象的存在，导致了单纯对c-met进行封闭往往不能完全的抑制肿瘤的复发和转移。因此，研究该通路下游机制和寻找关键分子作为新的或辅助治疗靶点对肿瘤复发转移的治疗有着非常重要的意义。
SMMC7721和 SF7721细胞系来源于同一亲本，其转移潜能却有着显著的差别，因而成为研究SF/HGF-c-met下游信号转导差异的理想材料。我们通过这一模型对其基因表达作基因芯片分析，初步筛选出57个表达差异的基因，大多数与转移相关。其中有一个非常显著的现象是存在高转移潜能细胞系SF7721存在着细胞骨架基因的过表达。有文献报道细胞骨架的重排可增强细胞分裂运动能力，导致肿瘤的远处转移，SF/HGF可引起细胞骨架蛋白actin 和beta-tubulin 表达增高，并可导致细胞骨架F-actin的重新分布，促进细胞板状伪足和丝状伪足的形成，为肿瘤侵袭提供基础（2）。Ezrin是HGF的下游分子, 它是一种胞膜与细胞骨架的连接蛋白，HGF-c-Met 通路的激活可引起ezrin的磷酸化，进一步引发骨架蛋白的重新分布。已有研究证明，在多种肿瘤如胰腺癌、前列腺癌、肺癌等中，Ezrin高表达，而且Ezrin在肿瘤侵袭前缘表达增强，转移灶Ezrin表达明显高于原发灶，表明其表达水平与肿瘤侵袭相关（3, 4）。在本次申请中，我们将对此进行更进一步的研究。拟利用RNA干扰技术，针对HGF-c-Met基因下游关键转导因子Ezrin和F-actin进行封闭观察肿瘤生长和转移情况。RNA干扰技术是一种转录后序列特异性的基因剪切，它由双链RNA（dsRNA）所启动，导致与dsRNA序列互补的同源性的mRNA降解。这项新技术已经被成功的应用于抗病毒复制和抑制肿瘤形成(5)，它与传统的反义核苷酸技术相比，具有转录效率高特异性强的优点(6)。最近报道的通过DNA载体导入哺乳动物细胞小干扰RNA（siRNA）的技术，进一步的扩展了RNA干扰技术的应用范围(7,8)。用RNA干扰技术抑制肿瘤的复发和转移已经成为肿瘤学研究的热点(9-11)。RNA干扰是普遍存在于自然界动植物细胞内的一种现象，与经典的细胞毒药物相比，具有更好的选择性毒副作用小不受细胞抗药性的影响，尤其对晚期肿瘤及转移性肿瘤具有独到的疗效，有希望成为新一代抗癌药物，这也是本研究的潜在应用价值和意义之一。
综上所述，本研究的深入有两方面的意义：一，促进抗肿瘤药物的开发--RNA干扰技术是当前最为看好的方案之一，该研究将进一步推动导向性基因治疗；二，进一步探索SF/HGF-c-met信号转导网络及其下游分子--该研究将为肿瘤转移相关基因的发现提供重要线索。
参考文献
1.Xie Q, Liu KD, Hu MY, et al. SF/HCF-c-met autocrine and paracrine promote metastasis in hepatocyte carcinoma. World journal of gastroenterology.
2.Henglin Yan and Scott A. Hepatocyte Growth Factor Stimulates The Proliferation and Migration of Oligodendrocyte Precursor Cells. Journal of Neuroscience Research 2002,69:597-606.
3. Yanlin Yu, Javed Khan, Chand Knanna, et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six-1 as key metastasic regulators. Nature medicine. January 2004:966.
4. Chand Knanna, Xiaolin Wang , Seuli Bose, et al. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nature medicine, January 2004:982.
5. Quan-Chu Wang, Qing-He Nie, Zhi-Hua Feng. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J Gastroenterol, 2003;9(8):1007-9327.
6. David J. Shuey, Daniel E. McCallus and Tony Giordano. RNAi: gene- silencing in therapeutic intervention. Therapeutic focus, 2002(7):1040-1046.
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8.Thijn R. Brummelkamp, Rene bernards, Reuven Agami. a system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian Cells.Science, 2002(296): 550-553.
9. Lin Zhang, Nuo Yang, Alisha Mohamed-Hadley, et al. vector-based RNAi, a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer. BBRC, 2003(303):1169-1178.
10.Kaiyi Li, Shiaw-Yih Lin, F, Charles Brunicardi, et al. Use of RNA Interference to target Cyclin E-overxpressing hepatocellular Carcinoma.Cancer Res, 2003(63) : 3593-3597.
11.Maria E. Ramos-N, ino, Luca Scapoli, Martinelli, Susan Land, et al. microarray analysis and RNA Silencing Link fra-1 to cd44 and c-met expression in mesothelioma. Cancer Res, 2003(63):3539-3545.
二、 研究内容和技术关键
（一）总体目标：进一步探寻HGF—c-met通路下游关键分子。以ezrin 和F-actin为靶分子，评估RNAi技术在体内外转染率及封闭效果，并对这一方法的可行性作出总体评价。
（二）研究内容
1. ezrin 和F-actin在高低转移肝癌细胞系中的表达及细胞内分布差异。
研究对象：高转移选取MHCC-I，MHCC-97H，SF-7721；低转移选取SMMC7721和MHCC-97L；另选两株国际通用肝癌细胞株：HEPG2和HEP3P；正常肝细胞选取Chang氏肝细胞。
研究方法：
l 免疫荧光法检测ezrin 和F-actin在高低转移肝癌细胞系中的表达及细胞内分布差异
l Real-time PCR 检测ezrin 和 各亚型actin mRNA表达差异
l Western-blot检测ezrin 和 各亚型actin蛋白表达差异
2. 分别针对ezrin 和F-actin化学合成siRNA对高转移肝癌细胞系生长转移能力的影响。
（1）体外实验
实验对象：SMMC7721/SF7721 或MHCC-97H/MHCC-97L
实验方法：
l 根椐siRNA设计原则设计针对ezrin和各亚型actin的siRNA, 进行化学合成。
l 转染后检测：Real-time PCR方法检测ezrin和actin mRNA转录水平随转染时间的变化。Western Blot检测蛋白表达随转染时间的变化，确定体外封闭的效果及其封闭的特异性.
l 转染后生物学行为鉴定：转染前后细胞形态学变化；流式细胞仪检测细胞周期。绘制生长曲线；MTT法测细胞增殖；体外细胞运动侵袭实验（transwell）。
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（2）体内实验：裸鼠接种
u 收集转染前后细胞各1×107作右侧腋下皮下接种。在接种后不同时间点处死裸鼠，观察肿瘤大小，同时取肿瘤，肺，淋巴结。提取肿瘤组织RNA和蛋白，待下一步检测。
u Real-time PCR方法检测接种后不同时间ezrin和actin mRNA转录水平的变化。
u Western Blot检测蛋白水平变化，确定体外封闭的效果及其封闭的特异性。
u 对肿瘤、肺和淋巴结作病理学检查。
3. 构建表达siRNA的质粒载体对ezrin 和actin的封闭
1．
根据www.ambion.com查询结果，针对敏感分子设计siRNA，合成DNA,利用分子克隆手段，将其插入到含RNA多聚酶III（U6）的siRNA表达载体。体内及体外实验方法同化学合成法。
（三）技术关键：RNA干扰技术的转染效率及其对目的基因封闭作用的特异性；RNA干扰技术体内封闭作用、持续时间及对临床应用的可行性。
（四）创新点： SMMC7721和SF7721及MHCC-97H/MHCC-97L细胞系均来源于同一亲体，但在转移性上有显著差异，是用于进一步研究SF/HGF-c-met的理想材料。这是一个创新点，也是进行本研究的有利条件。本研究首次应用RNA干扰技术观察转染前后癌细胞生物学行为的改变，将对肝癌的临床治疗提供重要线索。
三、执行年限和技术进度
起止年限：2004.6-2006.6
2004/6-2004/12 完成ezrin 和F-actin在高低转移肝癌细胞系中的表达及细胞内分布差异的检测
2005/1-2005/6 完成化学合成干扰RNA对对肝癌成长和转移的体内外效果评估。
2005/6-2005/9 完成质粒构建工作。
2005/10-2006/3 完成质粒构建干扰RNA对对肝癌成长和转移的体内外效果评估。
2006/4-2006/6 结题，论文发表。
四、工作条件和环境保障
（一） 有的工作基础：
l 已建立起具我国知识产权的MHCC—97及SF7721 高转移肝癌细胞系及通过转染获得了不同转移潜能的肝癌细胞系，作为研究对象。
l 已利用利用c-Met癌基因反义寡核苷酸链，c-Met反义核酸质粒及U1SnRNA/核酶/反义c-Met复合体质粒转染肝癌SF7721细胞系，对c-Met进行转录水平上的封闭，有明显的抑瘤效果，可供参考。
l 通过初步的基因芯片分析，已确定有57个候选基因有2倍以上差异表达，其中共有14个基因表达上调，43个基因表达上调。3倍以上差异表达共10个。其中已明确与肿瘤转移相关的基因有硫酸软骨素核心蛋白（CSPG core protein），内皮素受体（ETR endothelin receptor）下调。与肿瘤增殖有关的基因有Cyclin G2，gas5，BCL2等；与细胞黏附和骨架有关的有HEF1，Tubulin等；与转录相关的有MBD3，DNMT，RNA多聚酶II，NSAP1等；与信号传导有关的有TRAP2，AF1，丝氨酸激酶等；并涉及癌基因和抑癌基因c-myc，Gravin，Mxil等。除此以外，尚有一些差异表达的基因功能不明确或未定论。这一研究结果为我们进一步研究SF/HGFc-met信号转导的途径及作用提供了宝贵基础。
l 已有研究肝癌侵袭分子的研究基础
（二） 实验条件
u 实验研究中心具备所有分子生物学实验条件
u 中山医院动物中心已有完成动物实验的必要设施及动物模型。
五、成果形式和考核指标
成果形式：
1．成功构建针对SF/HGFc-met信号转导通路下游分子ezrin和F-actin的干扰RNA和转录干扰RNA的质粒。
2、探索SF/HGFc-met信号转导通路下游分子与肝癌生长和转移的的关系及信号阻断的研究，并评价其用于肝癌生长和转移治疗的可行性，发表国内外论文3-4篇（SCI 收录）
考核指标：
1、干扰RNA或质粒的鉴定及其体外效应：转染前后细胞生长曲线，基因转录和蛋白表达随转染时间的变化，穿膜实验评价癌细胞生长和转移潜能的变化，评价抑制疗效。
2、体内抑制效果评价：干扰RNA或质粒转染高转移潜能的细胞系，裸鼠皮下成瘤，观察成瘤率和转移率的变化，评价抑制疗效。
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六、预期效果和风险分析
效果和产业化前景：
1、社会效益：为抑制肝癌生长和转移提供新的理论基础和研究经验。
2、产业化前景：如初期结果能达到预期的目标，将考虑进入临床I期实验，有宽广的产业化前景。
3、风险分析：抑瘤效果不能达到预期的目标。
与课题有关论文：
1．c-Met信号阻断对肝癌细胞生长和运动能力的影响. 中华肝脏杂志 2003，11：487。
2．血清肝细胞生长因子在慢性肝病中的意义. 中华消化杂志 2003，23：349.
3. 血清肝细胞生长因子检测与肝硬化发病相关性分析. 中华检验医学杂志 2004. 27：104。
4. Role of SF/HGF-c-met autocrine and paracrine in metastasis of hepatocellular carcinoma. W.J.G 2001，7：816。
5．SF/HGF-c-met基因表达对肝癌细胞转移能力的影响 实用癌症杂志.2001，16：117。
6．SF/HGF-c-met信号传导对肝癌转移能力的影响. 中国学术期刊文摘 2001，7：1578。
7．离散因子/肝细胞生长因子cDNA转染对肝癌7721细胞生长和转移的影响.中华肝脏杂志，2001，9：95。
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