1．主要研究内容、拟解决的技术难点，以及预期达到的目标、主要技术指标和水平

主要研究内容

    3年来在国家自然科学基金、国家“863”及多项基金资助下进行针对端粒酶催化亚单位（hEST2）的反义寡核苷酸抗肿瘤研究。通过设计、合成、修饰和筛选得到一条抗肿瘤活性最佳的序列，对裸鼠人移植性肿瘤的最大抑瘤率达89.9%，被命名为“癌泰得”。本课题目的在于对“癌泰得”临床前研究中的中试生产、药理毒理学等进行研究，从而开发出国内第一个具有抗肿瘤活性的新型反义类药物。

(1)  “癌泰得”的药学研究

l 中试研究：生产工艺研究产品质量, 三批中试产品制造，检定规程，制剂，初步稳定性试验

l 药学其它：序列测定，生产用原料质控，标准品制备和检定，处方确定

(2) “癌泰得”的临床前药理学和毒理学研究

l 药理学研究：主要药效学，一般药理学试验，药代动力学试验

l 毒理学研究：单次给药和重复给药毒性试验，特殊毒理和免疫毒性试验

(3) “癌泰得”申报临床试验

l 三批中试产品送检

l 撰写申报临床试验的文件并申报

拟解决的关键技术难点

(1) 中试生产的规模。目前我们已有克级的DNA合成仪，临床试验时要求达公斤级            的DNA合成仪，如Oligo Process System，届时将由合作的公司购买。

(2) 在临床前药代动力学研究中血液和组织中反义寡核苷酸原型药的检测及方法的灵 敏度能否达到要求。

预期达到的目标

    按I类新生物制品要求完成临床前所有工作并获得临床试验的批文。

主要技术指标和水平

l 中试生产规模达10克/批以上（临床试验前达到500g-1000g/天）平均缩合率大于98.5%，产品纯度大于95％，回收率80%以上。满足临床前研究的要求。

l 主要药效学试验中，依给药剂量和给药持续时间，抑瘤率在40%-70％。

l 药代动力学试验中，原型药和代谢产物检测方法的灵敏度能检出3-5个半衰期后的血药浓度，检出相差1个碱基的代谢产物。

l 毒理学试验中，端粒酶的反义寡核苷酸的安全剂量应高于药效学有效剂量，毒性限制剂量应在药效学有效剂量的10倍以上。

2．预期可获得的发明专利等知识产权情况

获利发明专利1－2项。

3．课题主要研究技术内容的国内外发展现状与趋势，国内现有技术基础，以及与课题有关的技术领域的国内外专利申请和授权情况（附有关专利查新结论）

(1) 国内外发展现状与趋势及国内现有技术基础:

反义药物可在基因水平特异性阻断特定基因的表达，因此被认为是一种很有希望的高选择性和高效率的潜在疾病治疗药物。随着功能基因组学的深入研究，将会有越来越多的疾病相关基因及药物作用靶标被发现。反义核酸作为以基因为药靶的新一代药物将发挥更大优势。目前利用反义核酸作为药物和基因功能研究的文献呈爆发式增加的趋势。目前已有一种反义核酸在美国上市，另有16种反义核酸药物在进行临床实验。国内在该领域也做了大量的研究工作，但没有一个反义药物进入临床试验阶段，有待于在靶标的选择和合成规模等方面取得重大突破。随着人类基因组计划的深入，特别是后基因组计划的实施，将会有越来越多的疾病相关基因及药物作用靶标被发现。反义核酸作为基因为靶的新一代药物将会发挥其更大的优势。

端粒(telomere)是真核细胞染色体末端一段重复DNA序列，其功能是保持染色体的稳定性。端粒DNA的长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞的癌变密切相关。端粒酶是由一条单链RNA(hTR)和一些蛋白质亚单位组成的核糖核蛋白复合物。研究结果表明，恶性肿瘤端粒酶阳性率为85-90%；正常组织除胚细胞和造血细胞外，无端粒酶活性，癌旁组织端粒酶阳性率为6%；良性瘤和癌前病变组织端粒酶阳性率为14%。这表明端粒酶在癌细胞的形成和增殖中起着重要的作用。端粒酶作为恶性肿瘤标志物愈来愈被人们所接受。研究表明端粒酶的抑制可引起肿瘤细胞凋亡或诱导其分化, 抑制端粒酶的活性有可能抑制癌细胞的生长，从而达到治疗癌症的目的。因而端粒酶被认为是潜在的肿瘤治疗新靶点。

国外有人针对端粒酶RNA部分设计了一种锤头型核酶，在体外可以切割端粒酶RNA，抑制端粒酶活性。Norton等针对端粒酶RNA模板区设计合成了不同长度的硫代反义寡核苷酸(S-ASODN)和肽核酸(PNA)对恶性肿瘤细胞提取物中的端粒酶和细胞内的端粒酶均有不同程度的抑制作用。Feng等构建了反义 hTR表达载体，转染Hela细胞，经过23-26代，细胞端粒缩短，细胞开始死亡。Mata等使用6个碱基硫代反义寡核苷酸（TTAGGG）抑制Burkitt 淋巴细胞体外生长和接种裸鼠的肿瘤生长均取了较好的结果。

(2) 与课题有关的技术领域的国内外专利申请及授权情况（附有关专利查新结论）:

  有关端粒酶具有逆转录酶活性蛋白亚基及其反义药物的抗肿瘤研究国内外均有专利申请，其中国内专利属于课题组前期工作，国外专利也有一项属于本课题组的工作。

4．课题拟采取的研究方法（或技术路线、实施方案）及其可行性和风险分析

研究方法:

(1) “癌泰得”的中试研究

l 生产工艺的研究：采用固相“流过式”自动法合成，离子交换－反相法纯化产品。

l 中试产品质量研究和活性测定方法建立：采用毛细管电泳检测产品纯度，结构采用质谱法，定量采用HPLC法，活性采用体外端粒酶活性测定法。

l 中试产品生产和检定规程草案。

l 三批中试产品的初步稳定性试验和制剂处方的研究。

l 三批中试品的送检。

l 端粒酶反义寡核苷酸序列的确证：采用生物质谱法。

(2) “癌泰得”的临床前药理学和毒理学研究

l 主要药效学研究：在体外进行抗瘤谱的筛选。再进行敏感瘤株的体外和体内（裸鼠）抗瘤试验。至少重复三次。严格设置阳性对照药。

l 一般药理学试验：在安全剂量范围内观察端粒酶反义寡核苷酸对精神、心血管系统和呼吸系统的影响。

l 药代动力学研究：观察反义序列的组织器官分布、测定药代动力学参数（Vc、t_1/2 和CLs等）和代谢转化。采用固相提取法、毛细管凝胶电泳、荧光标记和质谱分析相结合方法检测。

l 毒理学试验。观察单次给药和重复给药后在动物的潜在毒性和毒性靶器官。

(3) 撰写申报“癌泰得”临床试验的资料，申报临床试验。

可行性分析和风险分析:

(1) 技术及条件的可行性：课题组成员已掌握反义寡核苷酸的合成、化学修饰、纯化及端粒酶活性检测等方面技术。在临床前评价方面，课题组成员从事生物技术药物临床前评价已有多年，建立了较为完整的生物技术药物临床前评价的实验技术和方法，同时有较多的有关反义核酸药物临床前评价的国外文献资料可供借鉴。因此从技术上完成本课题的工作是可行的。

(2) 工作基础：前期工作包括合成方法研究、三批小试合成和纯化、质量检验、LD50、药效学试验和采用荧光标记结合CE测定反义寡核苷酸的浓度等。结果表明，我们所设计和合成的“癌泰得”毒性小（LD₅₀大于1g/kg），对肝癌(HepG2)、肺癌(GLC)、脑胶质瘤(BT325)、胃癌(BGC823)及乳腺癌(MCF-7)细胞均有不同程度的抑制作用，具有明显的抗裸鼠移植性肿瘤生长作用。因此，预计通过对端粒酶反义寡核苷酸进行系统的临床前研究最终能进入临床试验。

(3) 风险分析：本课题的难点在于中试生产和临床前药代动力学方法学的研究。反义寡核苷酸可采用自动化DNA合成仪合成，目前国外有10g-500g/批合成规模的商业化仪器。由于采用自动化合成，因此能满足临床前的中试生产规模要求。在药代动力学方法学研究方面，有基因重组产品的药代动力学研究的丰富经验，近年我们对反义核酸的检测方法进行了探索，采用荧光标记方法，结合毛细管凝胶电泳法可达到定量检测的要求。因此要达到本课题目标的风险较小。

5．预期研究成果应用转化的前景预测及分析（包括国内外应用或市场现状、潜在用户、市场前景及风险预测, 经济效益和社会作用、影响分析等）

国内外应用或市场现状：

目前已有16种反义寡核苷酸药物进入临床试验，包括针对感染性疾病、癌症及炎症的反义寡核苷酸，有1种药物获得FDA批准进入市场。反义药物在临床前实验及临床试验中取得了喜人的结果，进一步促进了反义技术的发展。但目前无针对端粒酶的反义药物进入临床试验。

潜在用户及市场前景及风险预测：

本课题的研究成果，获利新药临床试验的批文。目前国内尚无反义类药物进入临床试验。由于国外反义药物试验结果较好，陆续有反义药物进入临床试验，反义药物逐渐受到国内外重视。我们研究的针对端粒酶的反义药物，药靶明确及特异，试验结果发现具有较强的抗肿瘤活性。目前已有企业合作，愿共同出资开发这一新药。

药物治疗是恶性肿瘤的主要治疗方法之一。但目前市场上缺少针对特定靶分子、效果较为理想的抗肿瘤药物，尤其是对实体瘤和耐药肿瘤的有效的药物。因此，本课题最终成果应具有较好的市场前景。

由于本课题具有较好的先期工作基础，表明其质量可控和有效，参照国外经验，我们认为达到本课题目标的风险较小。

经济效益和社会作用、影响分析等：

肿瘤是目前威胁人类健康的最重要疾病之一，是人类健康和生命的头号杀手，发病率居10 种重大疾病的第二位，而且随着各种因素的影响其发病率依然呈上升趋势。据报导目前欧美每年诊断出的癌症新患者达250万。我国每年死于癌症的患者超过80万。据专家预测世界抗癌药物的市场年递增13％。从上述完全统计的数字可以看出研究和开发抗癌药物，特别是新型抗癌药物有仅具有非常重要的社会效益，而且其经济效益也是其它药物所无法比拟的。根据目前我国抗肿瘤生物制品的市场情况保守估计，该项目最终上市投产后平均年利润应超过5亿元人民币。

6．课题现有工作基础与申请单位承诺提供的支撑条件，其他所需增添的支撑条件和主要仪器设备（说明用途）

工作基础：

(1) 药学初步研究

l 已进行了三批小规模“癌泰得”的合成、纯化及质量控制方法的研究。利用本室的DNA合成仪合成了三批“癌泰得”，平均缩合率达98.5±0.5%。采用阴离子加反相柱层析法纯化了三批合成硫代“癌泰得”，平均回收率85.0±2.0%。，用阴离子交换HPLC和毛细胞管凝胶电泳方法对硫代hEST212进行定性分析和质量控制，可分辨n-1及非硫代“癌泰得”。

l 针对人端粒酶具有逆转录酶活性蛋白质亚基（hEST2）的反义寡核苷酸的靶位筛选和序列长度的优化。根据序列和RNA二级结构特征，利用相应软件设计和合成了20条硫代反义寡核苷酸，观察在体外和体内的抗肿瘤活性。其中一条序列“癌泰得”抑瘤率达89.9%，申请了中国和国际专利。国内专利公开号为CN1253179A，国际专利号为PCT/CN99/00173。

(2) 临床前药理毒理学初步研究

l “癌泰得”作用的序列特异性分析。通过合成正义、随机（碱基组成相同）及错配的序列（GC含量相同）及硫代修饰，在体外观察到“癌泰得”（0.2、0.4和0.8mmol/L）抑制肿瘤细胞生长（HepG2）最高达65.0%，表明“癌泰得”的序列作用特异性。

l “癌泰得”抗瘤谱和作用时间的研究。在体外观察到“癌泰得”对胃癌细胞（BGC-823）作用最强（EC₅₀为0.25mmol/L），对肝癌、肺癌和乳腺癌的作用强度中等。连续作用4天，“癌泰得”的体外抗瘤活性达峰值。

l “癌泰得”对裸鼠肝移植瘤抗癌活性的研究。腹腔注射10天“癌泰得”12.5 mg/kg、25 mg/kg和50mg/kg，抑瘤率分别为29.4%、 47.9%和52.7%。静脉注射25mg/kg抑瘤率为49.3%。其中连续腹腔注射“癌泰得”（6.2 mg/kg、12.5 mg/kg和25mg/kg）30天，最大抑瘤率达80％以上。

l 单次给药毒性试验。结果发现“癌泰得”在雌性小鼠的LD₅₀为1173.9 mg/kg，，雄性小鼠的LD₅₀为1098.8mg/kg。

提供的支撑条件

l 人员: 具有多学科长期从事反义核酸、细胞生物学、药理学、药物分析及临床前安全性评价等的专门人才参与本课题研究。大多数是具有博士或硕士学位的年轻人且在各自的研究领域有一定的工作经验。

l 已有的仪器设备: AKTA Oligopilot(Amersham-Pharmacia,14万USD)及390Z(ABD公司，11.7万USD)大规模DNA合成仪2台，用于组合寡核苷酸库、体内外活性实验用反义寡核苷酸的合成。3900高通量(48柱，ABD公司，13.0万USD)、单柱(ABD,2.0万USD)和双柱(ABD,3.0万USD)小规模DNA合成仪共3台，用于体外筛选和优化用多个小规模反义寡核苷酸的合成。制备和分析型高效液相色谱仪各1台(Waters,10.0万USD)，用于寡核苷酸的纯化和分析。毛细管电泳仪(Backman,MDQ，6万USD)，用于寡核苷酸质量分析。还有自动基因序列分析仪、g计数仪、全自动生化分析仪、全自动细胞计数仪、显微自动成像仪、组织切片机和八道生理分析仪等。

尚缺仪器设备

        从事该研究无需购置任何大型仪器和设备。

7．合作单位任务分工

反义核酸合成和组织申报临床试验。